文獻解析 | 2-甲基戊烷高壓冷凍路線

胞內復雜的生化環境（如大分子濃度高、不同細胞器區域大分子富集種類不同等），與體外實驗環境有根本性的差異。我們不能將細胞簡單地視作為一個大分子袋“bag of macromolecules"，更應該理解為由細胞器空間結構效應，及其生物活性緊密耦合構成的“智慧體"。因此，簡單的使用體外實驗結果去推斷胞內生化活動是不準確的，這也正是當下“原位結構生物學"和“細胞內生物化學"興起的原因。

細胞內部采用區室化管理模式，通過生物分子間相互作用強弱和特異性，形成不同的物理狀態。基于“液-液相分離"理論，較弱且多價的相互作用形成生物分子聚集體，即無膜細胞器。其具有相對靈活的運行機制，能夠快速響應胞內生化環境變化；強特異性相互作用則會形成穩定的固態組裝體，能夠鎖定生物分子，進行長期存儲。

在細胞內，生物分子聚集體和固態組裝體并不是一成不變的，而是一種動態連續的過程。比如，傳統觀點認為受細胞代謝狀態變化的影響，代謝酶可通過組裝形態變化增強內在催化活性。而越來越多的研究者發現，這種形態變化同樣受制于空間效應，以便在復雜的胞內生化環境中，調控生物分子的擴散距離、局部濃度和酶穩定性。目前，這類細胞內生物大分子組裝體，在細胞生理活動中的作用仍然是個謎。這就需要我們在天然細胞環境下開展研究工作，并將其功能與結構相結合，揭示這些組裝體背后的秘密。

Cryo-ET技術能夠在“接近天然含水狀態"的完整細胞里，看清單個蛋白質分子原子級排布，揭示出與體外純化實驗截然不同的架構和功能狀態。在該研究工作中，作者以小鼠肝臟的過氧化物酶為研究載體，發現了一種從未描述過的超分子組裝體，解析了其組成、架構、機制、酶活性和進化保守性，突破性地發現了該高階組裝支持其發揮功能，卻不改變內在催化活性的特征。

本推文將圍繞2-甲基戊烷高壓冷凍路線，首先詳細介紹實驗方法與步驟，接著重構所得小鼠肝臟cryo-ET數據，并解析尿酸氧化酶（UOX）原位結構和功能。

Figure 1：小鼠肝細胞過氧化物酶體中，尿酸氧化酶（UOX）超分子組裝結構。a. 高壓冷凍制備小鼠肝臟組織所得的1.1 nm厚度切片圖像。其中，黃色箭頭所指為過氧化物酶體中的UOX超分子組裝結構。其中，Pero為過氧化物酶體；Mito為線粒體；標尺為100 nm；b. 切片a區域的3D重構結果。其中，黃色代表線粒體；品紅色代表內質網膜；灰色代表核糖體；綠色代表過氧物酶體；橙色代表UOX組裝結構。圖中標尺為100 nm；c-d. c為UOX組裝結構頂部切片視圖，d為相應的概覽圖。圖中標尺為10 nm；e-f. e為UOX組裝結構側視圖，f為相應的概覽圖。圖中標尺為10 nm；g-h. g和h分別為UOX組裝結構中，最小重復結構的概覽圖和子斷層圖像平均圖；i-j. i和j分別為UOX組裝結構中，單根螺旋纖維的概覽圖和子斷層圖像平均圖；k. 從斷層掃描中測得的過氧化物酶體直徑分布的violin 圖；l. 含有不同數量UOX組裝結構的過氧化物酶體數量；m. 上圖為小鼠尿酸氧化酶單顆粒冷凍電鏡圖像，下圖為原子模型。

Supplementary Figure 1：小鼠肝臟組織冷凍電子斷層掃描結果a. 組織樣本冷凍電子斷層掃描制樣路線和小鼠肝臟組織數據采集方法；b-f. 上述制樣路線所獲得的小鼠肝臟斷層掃描數據。其中，黃色箭頭指向尿酸氧化酶（UOX）超分子組裝結構。圖中標尺為100 nm；g. f切片區域的3D重構結果。其中，黃色代表線粒體；品紅色代表內質網膜；灰色代表核糖體；綠色代表過氧物酶體；橙色代表UOX組裝結構。圖中標尺為100 nm；h. UOX組裝結構不同Z軸位置切片圖像，左中右分別為底部、中間和頂部切片。圖中標尺為10 nm。

實驗試劑：

2-甲基戊烷；PBS緩沖液（20% w/v葡聚糖+5% w/v蔗糖）；乙烷和丙烷混合氣（比例為：36.9%:63.1%）

耗材：

200目載網（碳支持膜）；6 mm Type A高壓冷凍銅盤；6 mm藍寶石片

實驗步驟（Supplementary Figure 1a）：

1、使用輝光放電儀對載網進行親水化處理，每次須使用剛處理的載網；

2、在高壓冷凍儀中，裝載半圓彈道、中間板、墊圈和6 mm Type A銅盤，200 μm凹槽向上，放入載網；

3、解剖小鼠，取肝臟組織切片，在含有葡聚糖和蔗糖的PBS緩沖液中，浸泡30秒；

4、將肝臟組織切片放置于載網上；

5、在銅盤槽內滴加2-甲基戊烷；

6、蓋上6 mm藍寶石片；

7、合上高壓冷凍蓋板，完成高壓冷凍實驗；

8、將銅盤、載網、樣品和藍寶石在液氮環境下，轉移到-170攝氏度液態乙烷和丙烷混合液中，溶解2-甲基戊烷；

9、將載網和樣品在液氮環境下，轉移并儲存，待下一步進行FIB減薄制備lamella。

研究者們使用了組織樣品制備路線，解析了小鼠肝臟組織的亞細胞結構，可視化了眾多細胞器及其相互作用，驗證了肝臟組織代謝中心的作用（Supplementary Figure 1）。在研究過程中，意外地在單層膜細胞器中觀察到了一種大型超分子組裝體，并且其具有明顯的周期性模式（Figure 1a-b, Supplementary Figure 1b-g）。在這些組裝體中，能夠觀察到平行的絲狀單元，其間距約為4或者8 nm，數量從數個到數十個不等（Figure 1e-f, Supplementary Figure 1i）。其正交視圖顯示為空心管狀結構，間距為10 nm，取向角為144°（Figure 1c-d, Supplementary Figure 1h）。同時，在三維結構中能夠觀察到，這些絲狀單元最終會組成不規則彎曲的片狀結構（Figure 1b, Supplementary Figure 1g）。UOX組裝體的精細結構表明，其高階組裝是UOX同源四聚體之間通過弱的多價相互作用結合形成的，其中涉及數個短的結構基序。上述結構是一種從未被表征的細胞內組裝體。

在結構上，UOX中空纖維架構的五重對稱性，沒有采用空間填充的晶體堆積方式，取而代之的是一種多孔的層狀組織，維持穩定性。這種固態組裝體，既能很好地保持底物可及性和產物擴散能力，同時賦予酶針對熱、蛋白酶和氧化應激的顯著保護。這種穩定化作用在過氧化物酶體環境中可能尤為有利（UOX催化反應的活性副產物）。

在該研究工作中，除了準確解析UOX結構以外，研究者們還詳盡分析了UOX組裝機制，深入解析了其幾何結構的作用。并且，盡管該結構在人類進化中丟失，但仍在小鼠體內保持，以此提出了對臨床轉化的啟示。

通訊作者介紹：

郭強，現任北京大學生命科學學院研究員，北大-清華生命科學聯合中心研究員。他專注于原位結構生物學研究，其團隊以冷凍光電聯用（CLEM）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）為核心技術，致力于在近生理條件下對亞細胞結構進行高分辨率三維成像，旨在從“細胞建筑學"（亞細胞結構如何構建功能細胞）和“生物大分子社會學"（大分子與細胞器間的相互關系）兩個層面，揭示生命活動的基本規律。他曾獲多項重要榮譽，包括2024年北京市杰出青年科學基金、2021年拜耳學者和博雅青年學者等。

文章使用Leica EM ICE多功能高壓冷凍儀可實現200μm厚組織無冰晶玻璃化固定，兼容各類電鏡載網，有效適配大組織樣品原位冷凍電鏡斷層成像整套實驗流程。

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